6 - أساسيات الزراعة بالأنسجةأولاً:العمل فى جو معقم Aspect work
تشتمل زراعة الأنسجة على عزل وزراعة خلايا منفردة أو أنسجة أو أعضاء نباتية من أجزاء النبات وزراعتها على بيئة غذائية سائلة أو شبه صلبة تحتوى على مكونات متكاملة حيث تشمل مصدر للكربون فى صورة السكريات مثل السكروز ومصدر للعناصر الكبرى والصغرى مثل النيتروجين والفوسفور والبوتاسيوم والكالسيوم والماغنسيوم والكبريت والحديد والمنجنيز والنيكل والكوبلت والزنك والنحاس والبورون والمولبيدنيم. كذلك تحتوى البيئة الغذائية على الفيتامينات والهرمونات بتركيزات متوازنة مما جعل البيئة الغذائية وسط ملائم لعديد من الفطريات والبكتريا التى تنتشر فى الجو والتى يمكن لها أن تتطفل على تلك البيئة الغذائية الغنية مما يؤدى إلى تلوثها لذلك كان من الواجب أن يتم تعقيم البيئة قبل استخدامها فى الزراعة وتعقيم الأدوات المستعملة وكذلك تعقيم الأنسجة " المنفصل النباتى " Explant المنزرعة فضلاً على اتمام الزراعة فى جو خالى من الكائنات الدقيقة التى تؤدى إلى تلوث تلك الزراعات وذلك بإتمام العمل داخل غرفة معقمة أو كابينة معقمة Clean Environment .
تشتمل زراعة الأنسجة على عزل وزراعة خلايا منفردة أو أنسجة أو أعضاء نباتية من أجزاء النبات وزراعتها على بيئة غذائية سائلة أو شبه صلبة تحتوى على مكونات متكاملة حيث تشمل مصدر للكربون فى صورة السكريات مثل السكروز ومصدر للعناصر الكبرى والصغرى مثل النيتروجين والفوسفور والبوتاسيوم والكالسيوم والماغنسيوم والكبريت والحديد والمنجنيز والنيكل والكوبلت والزنك والنحاس والبورون والمولبيدنيم. كذلك تحتوى البيئة الغذائية على الفيتامينات والهرمونات بتركيزات متوازنة مما جعل البيئة الغذائية وسط ملائم لعديد من الفطريات والبكتريا التى تنتشر فى الجو والتى يمكن لها أن تتطفل على تلك البيئة الغذائية الغنية مما يؤدى إلى تلوثها لذلك كان من الواجب أن يتم تعقيم البيئة قبل استخدامها فى الزراعة وتعقيم الأدوات المستعملة وكذلك تعقيم الأنسجة " المنفصل النباتى " Explant المنزرعة فضلاً على اتمام الزراعة فى جو خالى من الكائنات الدقيقة التى تؤدى إلى تلوث تلك الزراعات وذلك بإتمام العمل داخل غرفة معقمة أو كابينة معقمة Clean Environment .
ثانياً:التحكم فى الجو البيئى Environment Control
بعد إتمام عملية عزل الخلايا أو الأنسجة أو الأعضاء النباتية وزراعتها على البيئة الغذائية المناسبة يجب أن تحضن فى جو ملائم تتوفر فيه نسبة الرطوبة الملائمة ودرجة الحرارة وشدة الإضاءة المناسبة لذلك يجب توفر غرفة تحضين أو حضانة يمكن التحكم فى درجة حرارتها وشدة إضاءتها. كذلك يجب أن تشتمل على أرفف لوضع حوامل الأنابيب أو الدوارق وتعرض تلك الأرفف إلى إضاءة مناسبة حسب مرحلة الزراعة وتزود وحدة الإضاءة بميقاتى للتحكم فى طول فترات الإضاءة .
بعد إتمام عملية عزل الخلايا أو الأنسجة أو الأعضاء النباتية وزراعتها على البيئة الغذائية المناسبة يجب أن تحضن فى جو ملائم تتوفر فيه نسبة الرطوبة الملائمة ودرجة الحرارة وشدة الإضاءة المناسبة لذلك يجب توفر غرفة تحضين أو حضانة يمكن التحكم فى درجة حرارتها وشدة إضاءتها. كذلك يجب أن تشتمل على أرفف لوضع حوامل الأنابيب أو الدوارق وتعرض تلك الأرفف إلى إضاءة مناسبة حسب مرحلة الزراعة وتزود وحدة الإضاءة بميقاتى للتحكم فى طول فترات الإضاءة .
ثالثاً:الإمكانيات المعملية Laboratory Facilities
1-استعدادات النظافة Provision of clean
يجب أن يكون هناك إمكانيات عالية لنظافة معمل زراعة الأنسجة ومداومة ذلك بشكل روتينى يومى حتى يتحقق النجاح باستمرار فى استخدام هذا التكنيك بكفاءة عالية، ويتم ذلك بشفط الأتربة ميكانيكياً ومسح وترطيب الأرضيات وتنظيف المناضد والنوافذ والحضانات والثلاجات تنظيفاً جيداً. كذلك يجب غلق الأبواب غلقاً محكماً. كذلك يجب أن تكون الجدران والأرضيات والأسطح جميعها ناعمة الملمس سهلة التنظيف ويفضل أن تصنع أسطح المناضد Bench Surface من مادة الفورميكا Formica .
2-عمليات الغسيل Washing up
يجب أن تتم عمليات غسيل الأدوات والزجاجيات والدوارق والأنابيب غسلاً جيداً باستعمال الماء الدافئ لذلك يجب أن يحتوى معمل زراعة الأنسجة على مصدر للماء الدافئ فضلاً على ماء مقطر وذلك لشطف الزجاجيات به ولاستعماله فى تحضير البيئات. ويفضل الماء المقطر مرتين والمعروف باسم Double distilled water كذلك يفضل استخدام الماء الخالى من الأملاح خاصة الصغرى منها لسميتها للأنسجة الرهيفة المزروعة مثل النحاس لذلك يستعمل الماء المعاد تقطيره والمعروفة De-ionizer وفى حالة عدم توافر تلك الإمكانيات يمكن أن يمرر الماء المقطر مرتين على مرشح ايونى Ion exchange لفصل الأملاح المتأينة على الرزين وبذلك نحصل على ماء مقطر لثلاث مرات Triple distilled water وعند الرغبة فى تخزين الماء المقطر يجب أن يكون ذلك فى آنية مغطاة زجاجية أو بلاستيكية محكمة ويفضل عدم استعمال الماء المخزون لفترة طويلة حتى لا يكون قد تلوث بالطحالب والفطريات ويجب غسيل آنية الماء دورياً The containers should be cleaned regularly . ولعمليات الغسيل يجب أن يتوفر لها صوانى بلاستيكية Plastic bowls or plastic bucket وذلك لنقع الأنابيب والزجاجيات والأطباق البترى فيها فترة قبل الغسيل بالفرشاة . وبعد الغسيل تشطف عدة مرات بالماء المقطر وتترك عندئذ لتصفية الماء على الحوامل ثم تجفف بعد ذلك فى الفرن قبل تخزينها فى دولاب الزجاجيات لحمايتها من الأتربة.
ويفضل أن يحتوى معمل زراعة الأنسجة على ماكينة أتوماتيكية للغسيل Automatic washing machine لإجراء عمليات الغسيل الدورى ولتسهيل العمل ويجب الأخذ فى الاعتبار أن الغسيل اليدوى يفضل فى بعض الحالات . ويجب التخلص من النفايات والزجاج المكسور والبيئات الملوثة بعد تعقيمها بالأتوكلاف وذلك باستعمال أكياس من البلاستيك ذات الحافة المغلقة لكى تغلق باستمرار وتستبدل يومياً لتقليل التلوث بالمعمل والمحافظة على نظافته.
3-إعداد البيئة وتخزينها Media preparation and storage
تحضر البيئة الغذائية كما سبق الذكر من الأملاح المعدنية والفيتامينات والهرمونات والسكر بالإضافة إلى الأجار وعادة تحضر البيئة فى صورة Stocks عالى التركيز من كل من الأملاح والفيتامينات والهرمونات . وذلك يرفع تركيز تلك المواد إلى عشرة أضعاف × 10 أو مائة × 100 وتخزن تلك الـStocks فى زجاجات داكنة اللون أو فى قنينات زجاجية أو بلاستيكية Glass plastic vials وذلك داخل أماكن باردة وتشمل ثلاجة كهربائية، أو مبرد تحت الصفر (- 20 °م) Deep freezer أو تخزن فى مجفف Desecrator أو فى غرفة مبردة تحتوى على أرفف لتخزين البيئات الجاهزة أو الـ Stocks . ولتجهيز تلك البيئات يجب استعمال موازين دقيقة حساسة لوزن مكونات البيئة الدقيقة كذلك يجب استعمال مقلب مغتاطيسى Magnetic hot plate stirrer لتقليب الأملاح والفيتامينات والهرمونات أثناء إذابتها .
1-استعدادات النظافة Provision of clean
يجب أن يكون هناك إمكانيات عالية لنظافة معمل زراعة الأنسجة ومداومة ذلك بشكل روتينى يومى حتى يتحقق النجاح باستمرار فى استخدام هذا التكنيك بكفاءة عالية، ويتم ذلك بشفط الأتربة ميكانيكياً ومسح وترطيب الأرضيات وتنظيف المناضد والنوافذ والحضانات والثلاجات تنظيفاً جيداً. كذلك يجب غلق الأبواب غلقاً محكماً. كذلك يجب أن تكون الجدران والأرضيات والأسطح جميعها ناعمة الملمس سهلة التنظيف ويفضل أن تصنع أسطح المناضد Bench Surface من مادة الفورميكا Formica .
2-عمليات الغسيل Washing up
يجب أن تتم عمليات غسيل الأدوات والزجاجيات والدوارق والأنابيب غسلاً جيداً باستعمال الماء الدافئ لذلك يجب أن يحتوى معمل زراعة الأنسجة على مصدر للماء الدافئ فضلاً على ماء مقطر وذلك لشطف الزجاجيات به ولاستعماله فى تحضير البيئات. ويفضل الماء المقطر مرتين والمعروف باسم Double distilled water كذلك يفضل استخدام الماء الخالى من الأملاح خاصة الصغرى منها لسميتها للأنسجة الرهيفة المزروعة مثل النحاس لذلك يستعمل الماء المعاد تقطيره والمعروفة De-ionizer وفى حالة عدم توافر تلك الإمكانيات يمكن أن يمرر الماء المقطر مرتين على مرشح ايونى Ion exchange لفصل الأملاح المتأينة على الرزين وبذلك نحصل على ماء مقطر لثلاث مرات Triple distilled water وعند الرغبة فى تخزين الماء المقطر يجب أن يكون ذلك فى آنية مغطاة زجاجية أو بلاستيكية محكمة ويفضل عدم استعمال الماء المخزون لفترة طويلة حتى لا يكون قد تلوث بالطحالب والفطريات ويجب غسيل آنية الماء دورياً The containers should be cleaned regularly . ولعمليات الغسيل يجب أن يتوفر لها صوانى بلاستيكية Plastic bowls or plastic bucket وذلك لنقع الأنابيب والزجاجيات والأطباق البترى فيها فترة قبل الغسيل بالفرشاة . وبعد الغسيل تشطف عدة مرات بالماء المقطر وتترك عندئذ لتصفية الماء على الحوامل ثم تجفف بعد ذلك فى الفرن قبل تخزينها فى دولاب الزجاجيات لحمايتها من الأتربة.
ويفضل أن يحتوى معمل زراعة الأنسجة على ماكينة أتوماتيكية للغسيل Automatic washing machine لإجراء عمليات الغسيل الدورى ولتسهيل العمل ويجب الأخذ فى الاعتبار أن الغسيل اليدوى يفضل فى بعض الحالات . ويجب التخلص من النفايات والزجاج المكسور والبيئات الملوثة بعد تعقيمها بالأتوكلاف وذلك باستعمال أكياس من البلاستيك ذات الحافة المغلقة لكى تغلق باستمرار وتستبدل يومياً لتقليل التلوث بالمعمل والمحافظة على نظافته.
3-إعداد البيئة وتخزينها Media preparation and storage
تحضر البيئة الغذائية كما سبق الذكر من الأملاح المعدنية والفيتامينات والهرمونات والسكر بالإضافة إلى الأجار وعادة تحضر البيئة فى صورة Stocks عالى التركيز من كل من الأملاح والفيتامينات والهرمونات . وذلك يرفع تركيز تلك المواد إلى عشرة أضعاف × 10 أو مائة × 100 وتخزن تلك الـStocks فى زجاجات داكنة اللون أو فى قنينات زجاجية أو بلاستيكية Glass plastic vials وذلك داخل أماكن باردة وتشمل ثلاجة كهربائية، أو مبرد تحت الصفر (- 20 °م) Deep freezer أو تخزن فى مجفف Desecrator أو فى غرفة مبردة تحتوى على أرفف لتخزين البيئات الجاهزة أو الـ Stocks . ولتجهيز تلك البيئات يجب استعمال موازين دقيقة حساسة لوزن مكونات البيئة الدقيقة كذلك يجب استعمال مقلب مغتاطيسى Magnetic hot plate stirrer لتقليب الأملاح والفيتامينات والهرمونات أثناء إذابتها .
